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免疫共沉淀技术在探索可能信号转导机制中的应用
作者:管理员    发布于:2018-08-07 17:22:04    文字:【】【】【

在从事细胞信号转导的研究过程中我们常常需要探寻新的通路。在纵横交错,纷繁复杂的cross-talk中如何筛选可能的路径是signal transduction领域永恒的话题,而免疫共沉淀技术则是常用而简便的方法之一。
1. 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)技术是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。它能确定两种蛋白质在完整细胞内生理性的相互作用。
2. IP 利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合或细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC 片段揭示待检蛋白之间的相互关系。
以检测某受体与JAK-STAT是否相关为例,实验前需要提前预测Receptor X可能与JAKs中的哪一个结合(激活)。然后用X受体的抗体去拉复合物,再用JAK的抗体去进行WB检测。如果两种蛋白有相互作用,就会以复合物的形式存在于样品中。需要了解的是,用A蛋白的抗体去沉淀A蛋白,这时候沉淀下来的可能是A蛋白,也可能是A和其他蛋白的复合体。然后用B蛋白的抗体去检测沉淀下来的样品(WB),如果检测到B蛋白,就说明A蛋白和B蛋白是形成复合体的。具体的实验中,可以把A当作受体把B当做JAK,也可以反过来。与此同时,也应该检测受体激活的时候JAK-STAT是否同步激活,以及阻断JAK-STAT以后受体的下游信号是否也被阻断,这些都是证明可能存在的信号转导的直接的证据。
3. 其优点为:
1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

4. 其缺点为:
1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;
3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
5. 在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:
1)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
2)要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;
3)确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

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