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RNA的免疫共沉淀分离及检测
作者:管理员    发布于:2018-08-28 08:46:46    文字:【】【】【

非编码RNA的发现使得RNA领域再次成为了生命科学研究关注的焦点。因为RNA是一种不稳定的生物大分子,绝大多数的RNA都需要与特定的RNA结合蛋白质结合形成RNA/蛋白复合物才能稳定存在于细胞中;不仅如此,RNA与RNA结合蛋白之间的动态关联贯穿和伴随了RNA的转录合成、加工和修饰、胞内运输和定位、功能发挥及降解的整个生命循环。鉴于此,利用RNA结合蛋白分离或发现鉴定功能性RNA分子是RNA研究领域中一个不可或缺的研究方法。简单地说,就是利用RNA结合蛋白的抗体免疫沉淀RNA/蛋白复合物,再从沉淀的RNA/蛋白复合物中分离得到特定RNA结合蛋白的RNA;分离得到的RNA可以通过末端标记和变性胶电泳对RNA分子的大小进行鉴定,也可以利用高通量RNA测序方法对RNA序列进行分析。

 

●全部所用的溶液试剂均经过DEPC处理或由DEPC水配制。

●RNA抽提过种中乙醇漂洗步骤可以省略。

●RNA样品溶解与保存:TE(pH8。0)缓冲液。80℃(如果下一步操作涉及酶反应)100%de-ionicFormamide(如果下一步是电泳检测)

●熟练的RNA操作非常重要。RNase的污染可通过使用RNAZap处理操作环境得到降低。

 

1.  由组织或细胞裂解液免疫沉淀RNP复合物

 

1)可预先UV照射组织和细胞固定RNA/结合蛋白复合物。

 

2)使用预先冰浴冷却的PBS洗组织或细胞两次。

 

3)将裂解液加入组织样品中进行匀浆(细胞样品匀浆步骤可省略)。裂解液:

25 mmol/L Tris-HClpH7.5,150 mmol/L KCl,2 mmol/L EDTA,0.5%NP40,1 mmol/L NaF,1 mmol/L DTT,100 U/ml RNasin核糖核酸酶抑制剂,EDTA-free蛋白酶抑制剂。

 

4)样品裂解液在4℃下14000 r/min(16000 g)离心10 min,上清液将用于免疫沉淀。

 

5)将预平衡的ProteinA/GSepharosebeads与适量的抗体混匀,于4℃旋转混匀6 h左右。

 

6)将第3步骤中准备的上清液样品加入beads-抗体混合液中于4℃旋转混匀6 h以上或过夜。结合时间也取决抗体本身的质量和效率。

 

7)将混匀液于4℃,1000 r/min离心10 s,弃上清液,用冰浴冷的低盐漂洗液洗beads两次,每次5 min,冰上或4℃进行。随后再用高盐漂洗液洗beads两次,每次5 min,冰上或4℃进行。低盐漂洗液:(高盐漂洗液使用300 mmol/L的NaCl)50 mmol/L Tris-HClpH7.4,150 mmol/L NaCl(300 mmol/L),1 mmol/L MgCl2,0.05%NP40,2 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,100 U/ml RNasin核糖核酸酶抑制剂。

 

2.  小分子RNA的抽提

1)用ProteinaseK溶液重悬beads,55℃消化10 min。

2)再用常规的TRizol法抽提RNA,用乙醇沉淀。

 

3.  RNA5'端标记和电泳检测

1)用CalfIntestinalPhosphatase处理抽提得到的RNA,以去掉5'端磷酸基团。

 

2)经酚氯仿抽提和乙醇沉淀后,使用γ-32PATP标记RNA分子的5'末端。

 

3)将标记后的RNA分子通过15%聚丙烯酰胺尿素变性胶进行电泳分离,随后经放射自显影进行检测。

 

4.  Solexa高通量RNA测序

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