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细胞凋亡实验(流式法或Tunel法)

 
商品编号:
JSY-008
品牌:
金益柏
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产品介绍Product Description

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分类:生化检测

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一、服务介绍

       细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型,而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。凋亡是多基因严格控制的过程。

二、实验原理

        Annexin V/PI双染检测细胞凋亡:在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V 进行荧光素标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin VPI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

三、实验流程

1.细胞培养,接种6孔板;

2.按指定的方式诱导细胞凋亡;

3.不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞并离心收集;

4.重悬细胞,加Annexin V/PI染色;

5.流式细胞仪检测;

6.结果统计分析。 

四、服务说明

1.客户提供:培养好的细胞以及所需药品

2.公司提供:基本实验步骤、流式图片、数据分析结果、剩余药品。

3.实验周期: 1-2周左右,具体需要根据细胞生长情况及实验内容而定。


 

TUNEL

二、实验原理

       TUNEL法(terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法),也称DNA断裂的原位末端标记法。细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300 kb的大片段,然后大约30%的染色体DNACa2+Mg2+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180200 bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA3’-末端,再用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与衍生物上生物素结合(每个链霉亲和素至少可以再结合3个生物素分子),最后用DAB、过氧化氢与辣根过氧化物酶发生氧化、环化反应,形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色,最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色。

三、实验流程

1.收集处理后的细胞或石蜡切片脱蜡至水。

2.过氧化氢甲醇中浸洗,抑制内源性过氧化氢酶。

3.用蛋白酶K室温孵育15~30分钟。

4.滴加TUNEL反应混合液(即配即用,4oC避光),孵育60分钟,在荧光镜下(绿色)分析结果。

5.加入转化剂-POD,孵育20~30 min

6.加入DAB底物溶液,孵育5~10 min

8.中性树胶或者甘油封片,光镜下分析结果。

四、服务说明

1.客户提供:培养好的细胞以及所需药品;或者提供石蜡标本

2.公司提供:基本实验步骤、图片、数据分析结果、剩余药品

3.实验周期: 2-3周左右,具体需要根据细胞生长情况及实验内容而定。

电话:025-86228208 | 传真:025-86228208 | 电子邮件:lixlae@126.com
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